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        机构用户解决方案

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        Takara有担当:提供完善的新冠病毒检测体系和研讨数据

         
        一、WHO公布的新冠病毒检测RT-qPCR Protocol
        面对新冠病毒这个强大的敌人,全球生命科学研究人员在第一时间应对,给出了针对新冠病毒核酸不同位点的不同检测方案。
        新冠病毒基因组扩增子的相对位置
         
         
        上表内容翻译自WHO网站https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance
         
        二、Takara探针法One Step RT-qPCR家族
        Takara作为众多检测试剂盒生产厂商的长期合作伙伴,在春节期间全力以赴,迅速研发合成每种Protocol对应的检测引物、探针和标准品。中国疾病预防控制中心发表的文献中使用了荧光定量PCR试剂One Step PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time)(Code No. RR064),也因其高灵敏度、高扩增效率和高扩增特异性的特点,一直备受青睐。
         
        在2019年Takara新推出的性能更优、操作更简便的探针检测一步法RT-qPCR试剂One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix(Code No. RR600A)PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix(Code No. RR650A)也受到广泛关注。
         
        产品 Code No. 特点
        One Step PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time) RR064A/B probe法One Step RT-qPCR
        One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix RR600A/B 完全premix型probe法One Step RT-qPCR
        One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix, with UNG RR601A/B RR600的UNG版本,防止假阳性
        PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix RR650A/B 无需RNA纯化,直接进行probe法One Step RT-qPCR
        PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, with UNG RR651A/B RR650的UNG版本,防止假阳性
         
        三、使用Takara产品进行新冠病毒检测的研讨结果
        为了更好地服务科研人员,Takara研讨了使用上述产品按照美国 CDC Protocol对新冠病毒进行检测的结果,验证了检测灵敏度、扩增情况、多重PCR的实验条件等内容。
         
        1. 下面是美国CDC检测Protocol中的引物、探针和Control RNA序列
        Oligo name sequence (5' - 3') 5' 3' base Working Conc. Tm(℃)
        2019-nCoV_N1-F GACCCCAAAATCAGCGAAAT     20 1.5 μM 61.2
        2019-nCoV_N1-R TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG     24 1.5 μM 62.7
        2019-nCoV_N1-P ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC FAM BHQ1 24 0.375 μM 72.2
        2019-nCoV_N2-F TTACAAACATTGGCCGCAAA     20 1.5 μM 62.3
        2019-nCoV_N2-R GCGCGACATTCCGAAGAA     18 1.5 μM 63.4
        2019-nCoV_N2-P ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG FAM BHQ1 23 0.375 μM 72
        2019-nCoV_N3-F GGGAGCCTTGAATACACCAAAA     22 1.5 μM 62.4
        2019-nCoV_N3-R TGTAGCACGATTGCAGCATTG     21 1.5 μM 63.2
        2019-nCoV_N3-P AYCACATTGGCACCCGCAATCCTG FAM BHQ1 24 0.375 μM 73.6
        RP-F AGATTTGGACCTGCGAGCG     19 1.5 μM 63.8
        RP-R GAGCGGCTGTCTCCACAAGT     20 1.5 μM 62.9
        RP-P TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG FAM BHQ1 23 0.375 μM 72
         
          Oligo name sequence (5' - 3') base
        Control RNA US-N1 AUGGACCCCAAAAUCAGCGAAAUGCACCCCGCAUUACGUUUGGUGGACCCUCA
        GAUUCAACUGGCAGUAACCAGAAUG
        156
        US-N2 UGAUUACAAACAUUGGCCGCAAAUUGCACAAUUUGCCCCCAGCGCUUCAGCGU
        UCUUCGGAAUGUCGCGCAUU
        146
        US-N3 UGAGGGAGCCUUGAAUACACCAAAAGAUCACAUUGGCACCCGCAAUCCTGCUAA
        CAAUGCUGCAAUCGUGCUACAACU
        155
         
        2. 下面是按照美国CDC检测Protocol扩增的结果
        目的基因:N1 模板:Control RNA US-N1 5/50/500/5,000/50,000 copies
         
        目的基因:N2 模板:Control RNA US-N2 5/50/500/5,000/50,000 copies
         
        目的基因:N3 模板:Control RNA US-N3 5/50/500/5,000/50,000 copies
         
        目的基因:RP(RNAse P)基因 模板:HL60 RNA 10 pg/100 pg/1 ng/10 ng/100 ng
         
        结论:
        N1/N2/N3基因:50个拷贝能够被稳定检出,5个拷贝不能够被稳定检出。
        内对照RP基因在10 pg HL60 RNA中能够被检出。
         
        3. 多重定量PCR的研讨结果
        使用PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, with UNG(Code No.RR651)对N1基因+RP基因、N3基因+RP基因进行多重定量PCR检测。
         
        1) 多重定量PCR的研讨结果:
         
        2) 扩增曲线如下:
        US-N3基因扩增曲线更光滑,荧光信号更高,灵敏度为1~10拷贝。
        RP+N3多重PCR结果稳定。
         
        除了上述结果外,为了检测Takara产品对不同仪器的兼容性,我们还研讨了上述多重定量PCR在Takara、Thermo Fisher Scientific、Bio-Rad的定量PCR仪器上的扩增结果,RP+N3多重PCR无相互干扰,三种qPCR仪器均运行稳定,10 copies模板时Ct值≤38。
         
        Takara还将陆续推出更多新冠病毒检测的结果,包括使用PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, with UNG(Code No.RR651)不提取RNA而直接进行定量PCR的研讨,敬请关注。
         
        使用Takara探针检测One Step RT-qPCR Kits,按照日本国立传染病研究所在WHO发布的新冠病毒检测Protocol的详细实验条件和实验优化结果,请参考链接:
        https://www.takara-bio.co.jp/goods/info/info144.htm
         
         
        Takara愿与科研人员一起,用我们的专业专注,筑起对抗疫情的坚强防线。